mRNA：即messenger RNA 信使RNA是由DNA經(jīng)由轉(zhuǎn)錄而來，帶著相應(yīng)的遺傳訊息，為下一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)提供所需的訊息。在細胞中，mRNA從合成到被降解，經(jīng)過了數(shù)個步驟。在轉(zhuǎn)錄的過程中，第二型RNA聚合酶從DNA中復制出一段遺傳訊息到mRNA前體pre-mRNA上。在原核生物中，除了5'加帽之外mRNA并未被進一步處理而經(jīng)常是邊轉(zhuǎn)錄邊轉(zhuǎn)譯。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄跟轉(zhuǎn)譯發(fā)生在細胞的不同位置，轉(zhuǎn)錄發(fā)生在儲存DNA的細胞核中，而轉(zhuǎn)譯是發(fā)生在細胞質(zhì)中。

一、文庫類型

根據(jù)研究對象不同選擇相應(yīng)的建庫方法

    在測mRNA過程中，首先要去除rRNA。以人為例，在抽提的總RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的則是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整個人類當中是非常保守的，在各個組織器官中也是非常穩(wěn)定的，因此這些測序結(jié)果對我們的研究是沒有用處的。mRNA則是RNA中比較重要的部分。

二、建庫流程

    Illumina、Kapa公司的Truseq RNA建庫方法是應(yīng)用廣泛的一種，真核普通轉(zhuǎn)錄組為例：

首先以mRNA的Poly(A)(高等生物*的)這個特點，讓帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進行雜交，使mRNA和磁珠相結(jié)合在一起。接著回收磁珠，將帶有Poly(A)的mRNA從磁珠上洗脫下來。

然后用鎂離子溶液將洗脫下來的mRNA打成片段，被打斷的mRNA片段用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄出鏈的cDNA，再合成出第二鏈，這樣就有了雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA末端修復，加A加接頭。片段選擇，PCR擴增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結(jié)合試劑盒進一步純化）。

注：

    這個建庫方法對mRNA的完整性有較高要求，因此如果mRNA發(fā)生降解，那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA斷片，會在富集階段被洗脫，導致后數(shù)據(jù)有一定的偏差（在RNA測序質(zhì)控時就能發(fā)現(xiàn)mRNA的3’端以及5’端是否有偏移）。

    一般在會測序前對總RNA進行一次質(zhì)檢，根據(jù)電泳質(zhì)檢結(jié)果中的18S和28S（rRNA）兩個峰的高度以及峰的尖度來判斷RNA的質(zhì)量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。除了mRNA普通文庫構(gòu)建外，還有真核鏈特異性文庫、lncRNA文庫、SmallRNA文庫等。針對一些FF(Formalin-Fixed)樣本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蠟包埋樣本以及原核生物的總RNA中去除rRNA，不適合用上述mRNA建庫方法。需要結(jié)合RiboZero、RiboMinus等來去除，其實是針對rRNA序列進行雜交捕獲去除的原理來去除的。

    Oligo(dT)₃₀磁性微球是基于堿基互補配對原則以及mRNA含有poly(A)尾巴的特點設(shè)計而成，適用于從真核總RNA，或直接從細胞、部分病毒、動物和植物組織的粗提物中快速分離完整的高純度mRNA。

磁性微球產(chǎn)品訂購信息     

      產(chǎn)品名稱                                  貨號                                  儲存溫度                       保質(zhì)期

Oligo(dT) ₃₀ 磁性微球                    MS04T                                2-8℃                              2年

TruSeq standed mRNA Library Prep mRNA文庫構(gòu)建試劑盒

    KAPA mRNA文庫構(gòu)建試劑盒適用于illumina測序平臺，該試劑盒適用于去除了tRNA或富含poly(A)的10-400ng RNA為模板構(gòu)建RNA文庫所需的所有酶和緩沖液。

產(chǎn)品應(yīng)用：

• 基因表達；
• 新的轉(zhuǎn)錄本和SNP鑒定；
• 拼接位點及基因融合識別。

?產(chǎn)品優(yōu)勢

• 減少樣品手動操作及總的時間
• 從100ng ~ 4ug 的靈活DNA樣本量
• KAPA HiFi酶在文庫擴增中有強有力的表現(xiàn)
• 試劑及反應(yīng)體系便于自動化操作

?Kapa試劑盒產(chǎn)品訂購信息

品牌            貨號                                        名稱                                                             規(guī)格

KAPA        KK8420   KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平臺    24sample

KAPA        KK8421   KAPA Stranded mRNA-Seq Library Preparation Kit -illumina平臺    96sample

    TruSeq鏈式mRNA文庫制備試劑盒以精簡、經(jīng)濟及可擴展的方式對mRNA-Seq進行文庫制備，可測量鏈取向。準確測量基因和轉(zhuǎn)錄本豐度，并檢測編碼轉(zhuǎn)錄組中的已知特征和新特征。

產(chǎn)品英文名稱：TruSeq® Stranded mRNA Library Prep

產(chǎn)品中文名稱：TruSeq鏈式mRNA文庫制備試劑盒

Illumina  TruSeq鏈式mRNA文庫制備試劑盒特點

     TruSeq鏈式mRNA文庫制備試劑盒為編碼轉(zhuǎn)錄組分析提供了一個精簡、高性價比且可擴展的解決方案。它與多種樣本兼容。

精密準確

     此試劑盒可讓您測量mRNA鏈方向性以檢測反義轉(zhuǎn)錄本，并為您增強轉(zhuǎn)錄本注釋和提高比對效率。其提供高度均勻的覆蓋能力，可更好地發(fā)現(xiàn)可變剪切、基因融合和等位基因特異性表達等特征。

性價比高

     鏈信息可讓您識別RNA轉(zhuǎn)錄本來自于2條DNA鏈中的哪一條。此信息提高了轉(zhuǎn)錄本注釋的可信度，尤其針對非人類樣本。識別鏈起源可增加比對片段百分比，從而降低每個樣本的測序成本。

可擴展

      該試劑盒能可靠檢測標準和低質(zhì)量樣本，且其工作流程可與眾多不同的研究設(shè)計兼容

Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prep產(chǎn)品訂購信息

 品牌                       貨號                                      名稱                                             規(guī)格

Illumina             20020594         TruSeq® Stranded mRNA Library Prep              48 Samples

Illumina             20020595        TruSeq® Stranded mRNA Library Prep               96 Samples

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